耐甲氧西林金黄色葡萄球菌的基因多态性分型研究
葡萄球菌的分型方法很多,传统的分型方法包括血清学分型、抗生素分型等,但均无法满足精确辨别的要求。分子生物学技术的出现为这一领域带来了革命。目前,分子分型方法已成为研究细菌耐药性发生及传播的重要手段,常见的有:脉冲场凝胶电泳(pulsed-fiel gel electrophoresis, PFGE),随机扩增DNA多态性(random amplified polymorphic DNA, RAPD),mecA基因高变区长度多态性(PCR for the mec-associated hypervariable region, HVR-PCR),荧光扩增片段长度多态性(fluorescent amplified fragment length polymorphrism, FAFLP)等。这些方法各有特点,应用于耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin-resistant Staphylococcus aureu, MRSA)的分型在国内外均有报道,但这些方法尚未成熟,各地分型标准也不一样,且多采用单一的分型方法。RAPD 和HVR-PCR联合应用于MRSA多态性分型尚未见报道。本实验采用RAPD和HVR-PCR两种方法对MRSA菌株进行分型,了解其多态性分布状况、鉴别菌株之间的相关性,为合理、有效地使用抗生素和控制耐药基因在种群间的传播提供理论基础。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1标本来源实验用的31株MRSA标本来源于2007年3月至2007年12月间西安交通1.1.2实验仪器及试剂MicroScan auto Scan-4型全自动细菌鉴定分析;药敏试验纸片购自英国OXOID公司,Mueller-Hinton平板由本实验室自行配置;细菌基因组DNA提取试剂盒(DP302)、PCR试剂2×Taq PCR MasterMix(含染料)、DNA Marker Ⅱ均购自北京TIANGEN生物技术有限公司;溶菌酶(活力单位>2000u/mg)、蛋白酶K购自Amrescos生物公司;金黄色葡萄球菌mecA基因PCR检测引物和HVR-PCR、RAPD多态性分析引物,由北京奥科生物技术有限责任公司合成。DNA扩增仪为MJ Research Inc公司的PTC-200 PCR仪;稳压稳流电泳仪为美国Bio-RAD公司产品;ZF紫外分析仪购自上海小源科技有限公司。
1.2方法
1.2.1细菌鉴定用MicroScan auto Scan-4型全自动细菌鉴定分析仪鉴定MRSA,同时用PCR检测mecA基因,凡头孢西丁(FOX,30μg)纸片药敏试验≤19mm的金黄色葡萄球菌,且mecA基因阳性者报甲氧西林耐药,即为MRSA。
1.2.2PCR引物根据GenBank中金黄色葡萄球菌MRSA基因序列选取适用引物:HVR引物序列为,P1:5′-ACTATTCCCTCAGGCGTCC-3′,P2:5′-GGAGTTAATCTACGTCTCATC-3′[1],RAPD引物序列为,EP007:5′-AGCACGCTGTCAATCATGTA-3′[2],KAY1:5′-AGCAGCCTGC-3′[2]。
1.2.3细菌DNA的提取按北京TIANGEN公司生产的细菌基因提取试剂盒(DP302)步骤,提取葡萄球菌基因组DNA。
1.2.4MRSA的HVR-PCR分型取经药敏试验和基因检测为MRSA的菌株基因组DNA 1μL作为扩增的模板,加入PCR反应体系:HVR P1和P2引物各1μL(引物浓度10μmol/L),2×PCR Master 12.5μL(3mmol/L MgCl2、0.5mmol/L dNTP、0.1u/μL Taq DNA聚合酶、20mmol/L Tris-HCl、100mmol/L KCl,含染料),灭菌去离子水ddH2O 9.5μL,反应总体积为25μL。PCR反应条件:94℃预变性5min;94℃ 60s,56℃ 45s,72℃,60s,35个循环;72℃延伸5min。扩增产物经聚丙烯酰胺凝胶电泳,银染后分析结果。