荭草不同药用部位抗心肌缺血作用及化学成分比较研究
荭草为蓼科植物荭蓼Polygonum orientale L. 的干燥全草，生于路旁和水边湿地，分布较广，具有祛风利湿，活血消肿的功效，用于治疗风湿性关节炎、冠心病、疝气等[1]。据《中华本草》《中药大辞典》等记载[2，3]荭草的茎叶、果实、根和花均可作为不同部位入药，而且功能主治有所差异。而据现代药理学研究表明，以单味荭草制备的注射液有广泛的心血管系统药理活性，如增加心肌营养血流量及冠脉流量，改善急性心肌缺血缺氧状态，同时能减少心肌耗氧和提高机体在低氧状态下的氧利用能力;减弱离体心脏的收缩力和心率，能使外周血管扩张，血压轻度下降等[4，5]。贵州荭草资源丰富，民间将其用于治疗胸痹心痛，心胃气痛，但用药部位较为混乱。因此，为了更好地利用荭草的药用价值，有效开发药材资源，本研究采用实验性大鼠心肌缺血、兔离体心脏冠脉流量灌注实验对比考察了荭草不同药用部位的药效强度;化学成分研究的结果表明荭草主要含黄酮类和酚酸类成分[6]，根据文献[7~10]本研究对荭草不同部位中黄酮类成分异荭草素和荭草素、酚酸类成分原儿茶酸测定了含量，同时考察了各部位的HPLC指纹图谱，以期找到化学成分同心血管方面作用的有效部位之间的相关性，为其在心血管方面的临床应用提供实验研究依据。科技论文发表网站
1 仪器与材料
1.1 仪器岛津LC-10 A系列高效液相色谱仪;WML色谱工作站，南宁威玛龙色谱科技有限公司产品;心电图仪，日本NIHON KOHDEN公司产品;DH140人工呼吸器，浙江医科大学医学仪器实验厂产品。Langendorff法灌流装置。
1.2 药品与试剂荭草Polygonum orientale L.产地：贵州省惠水县，采收期9月，
由贵阳医学院药物研究所生药学研究室龙庆德副教授鉴定。复方丹参注射液，上海通用药业股份有限公司第三公司产品;异荭草素和荭草素对照品是从荭草中分离、纯化而得，经NMR、MS鉴定为异荭草素、荭草素(另文报道)，HPLC归一化法测定其纯度均在98%以上;原儿茶酸对照品(中国药品生物制品检定所)。硝基四氮唑蓝(NBT)，上海前进试剂厂产品。
1.3 动物 SD大鼠，体质量250～300 g;家兔，体质量 2～2.5 kg;雌雄兼用，由贵阳医学院实验动物中心提供，合格证号：SCXK(黔)2002-0001。
2方法
2.1 样品制备取荭草各药用部位(全株、根及粗茎、带叶茎枝、花穗)，水煎煮提取浓缩后65%乙醇沉淀，滤液浓缩，加水微热溶解，调pH至6，滴加明胶溶液至无沉淀产生，再加乙醇使含醇量达75%，静置，滤过，回收至近干，以注射用水稀释至每毫升含2 g生药，调pH值至7，煮沸，滤过，冷藏24 h，用0.45 μm微孔滤膜滤过，滤液分装，灭菌，备用。各药用部位样品分别记为A组、B组、C组、D组。
2.2 剂量设置 根据《贵州省中药材、民族药材质量标准》(2003 年版)荭草用药剂量和预试验药效学结果，设定了本实验剂量方案。
2.3抗实验性心肌缺血实验[11]科技论文发表网站
2.3.1 对大鼠急性心肌梗塞心电图的影响 取雄性SD大鼠，随机分为6组，分别为模型对照组，阳性对照组(复方丹参)，样品A(全株)组、B(根及粗茎)组、C(带叶茎枝)组、D(花穗)组。动物用10%乌拉坦麻醉，固定，将针形电极插入四肢皮下，连接心电图机，记录正常肢体Ⅱ导联心电图。打开胸腔前接上人工呼吸机，各组动物结扎左冠状动脉前降支后，迅速关闭胸腔，恢复呼吸，记录心电图，有明显J段抬高或压低者为手术成功征象(剔除未出现明显心肌梗塞心电图波形者)。结扎后即刻分别股静脉给药，模型组给予等体积生理盐水。记录结扎后5，15，30，60，120 min各时间点心电图，计算各时间J点上下偏移mV数。
2.3.2 对大鼠急性心肌梗塞范围的影响 实验结束后，立即取出心脏，用生理盐水洗净余血，剪去心房及各大血管、筋膜、心耳等，称取心室重量，然后将心肌切成等厚度的5片，置于37 ℃ 0.5%NBT染色液中染色10 min，取出剪去被染色的非梗塞心肌，称重未染色的梗塞区心肌，以重量法计算心肌缺血区百分率。
2.4对离体兔心冠脉流量的影响[11]取家兔，雌雄兼用，击后脑致昏，迅速开胸取出心脏，按Langendorff法主动脉插管，心脏固定在灌流装置上后，用恒温38 ℃±0.5 ℃且不间断通入纯氧的Ringer-Lock’s液灌流，灌流压恒定为50 cmH2O。待灌流稳定后，采取交叉给药法，分别由灌流侧管注入供试药液，观察记录给药前、后1 min的流量值。
2.5 异荭草素、荭草素和原儿茶酸含量测定 参照文献[7，8]方法，采用高效液相色谱法测定药材各部位上述指标。测定异荭草素、荭草素色谱条件：Diamonsil C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相乙腈-0.1%磷酸水溶液(18∶82)，流速1 ml·min-1，柱温40℃，检测波长350 nm;测定原儿茶酸色谱条件：Hypersil C18色谱柱(5 mm×250 mm，5 μm)，流动相甲醇-水(10∶90)，流速1 ml·min-1，柱温40 ℃，检测波长258 nm。
2.6 HPLC指纹图谱测定 参照文献方法[9，10]，采用高效液相色谱法测定药材各部位指纹图谱。色谱条件为：色谱柱Inersil ODS-3柱(4.6 mm×250 mm，5 μm，日本GL Sciences Inc.);流动相A为乙腈，B为0.1%磷酸，梯度洗脱：0 min～45 min，A(13%～21%);45 min～60 min，A(21%～33%)，柱温35 ℃;流速1 ml·min-1;检测波长 300 nm。
2.7 数据统计处理 数据以±s表示，采用Student’s-t检验。
3结果
3.1 对急性心肌梗塞心电图及梗塞范围和对离体心脏冠脉流量的影响模型组动物心电图出现明显波形改变，J点异常改变，心肌缺血程度持续加重。各药物组除荭草的根及粗茎样品组外，其他各组不同程度改善缺血性心肌心电图，使心肌缺血区的百分率降低，对急性心肌梗死有明显的保护作用，与模型对照组比较差异具有显著性(P<0.05或P<0.01);在对离体心脏冠脉流量的实验研究中，全株、带叶茎枝和花穗增加冠脉流量的作用最为明显(P<0.05或P<0.01)，同样根及粗茎效果不理想。综合两项药效学实验结果，荭草带叶茎枝和花穗是改善急性心肌缺血状态和心脏血液供应的有效部位。见表1～3。表1对大鼠结扎左冠状动脉前降支后ECG的影响表2对急性心肌梗塞范围的影响 表3对离体兔心冠脉流量的影响
3.2 荭草药材不同部位异荭草素、荭草素和原儿茶酸的含量 荭草不同药用部位异荭草素、荭草素和原儿茶酸的含量有显著性差异，以茎枝和叶的含量最高，根和粗茎仅含有少量异荭草素，几乎不含荭草素和原儿茶酸。结果见表4。表4荭草药材不同部位含量测定结果
3.3 荭草药材不同部位HPLC指纹图谱 各药用部位指纹图谱的差异直观而明显，根和粗茎的色谱峰较为单一，色谱峰的数量与强度都大大少于花穗和带叶茎枝;花穗和带叶茎枝色谱图的指纹信息较为丰富，具有各自的特征性，又具备一定的相似性，提示花穗和带叶茎枝的有着共同的物质基础。结果见图1～5。图1荭草药材根的HPLC指纹图谱图2荭草药材粗茎的HPLC指纹图谱图3荭草药材花穗的HPLC指纹图谱图4荭草药材带叶茎枝的HPLC指纹图谱图5荭草根、粗茎、花穗、带叶茎枝不同部位指纹图谱中主要峰峰面积棒状图科技论文发表网站
4讨论
在体情况下，心脏功能受前负荷、神经体液等因素的影响，很难评价药物对心脏的直接作用，因此本研究以Langendorff离体心脏冠脉灌流量实验，采用兔离体心脏模型比较观测了荭草不同药用部位对冠脉流量的影响。Langendorff法是筛选心血管药物的常用方法，常使用大鼠或豚鼠，但动物心脏太小操作不便且稳定性和重复性较差，本研究采用兔为实验对象，结果稳定、重复性好。
根据文献报道，荭草素在舒张血管平滑肌，保护急性缺血在体模型心肌、降低整体动物的心肌耗氧及增加心肌供血等方面[12~14]对心血管系统具有广泛的药理作用;原儿茶酸具有降低心肌氧耗、缓解心肌局部缺血的作用，在治疗心血管疾病方面也有良好的活性[15]，故在选择含量测定的指标成分时，既考虑荭草在心血管方面的应用，又兼顾药材中极性差别较大的黄酮类成分和酚酸类成分，确定了含量相对较高而化学性质稳定的荭草素及同系物异荭草素和原儿茶酸，尽量使测定的指标成分与药材药理活性一致。
本研究采用药效学试验结合化学指标成分及指纹图谱综合分析的方法，对贵州产药材荭草的根及粗茎、带叶茎枝、花穗等不同药用部位进行了比较研究。本研究表明，在心血管作用方面带叶茎枝和花穗具有较好的药理活性;理化性质研究的结果显示带叶茎枝和花穗中黄酮类化合物和有机酸类的含量较高，而根及粗茎中黄酮类化合物和有机酸类的含量极低，提示黄酮类化合物和有机酸可能为荭草的有效成分群;指纹图谱信息量的差异亦从更广泛的意义上反映了各药用部位物质基础共性与个性的关系。本研究的后续工作将放大样本量，更进一步、系统地比较荭草中黄酮和有机酸类成分在不同药用部位的分布及不同产地、采收季节等因素对其产生的影响。以上的研究工作，将为临床荭草药材的使用是否区分部位或地域提供科学的依据。
