维药蜜膏剂蜂蜜炼蜜工艺前后5-羟甲基糠醛的含量变化研究
1仪器与试药
1.1仪器Waters高效液相色谱仪，包括检测器：Waters2996二极管陈列检测器，泵Waters 600，Waters 717plus 自动进样器;色谱柱：Waters Symmetry C18 (150 mm×4.6 mm，5 μm)。BS110S电子天平(北京塞多利斯仪器系统有限公司);LS-3120超声波发生器(美国科学系统公司);油浴锅，电子温度计。
1.2试剂样品由新疆维吾尔医药研究所维药药剂学国家三级实验室制备;蜂蜜样品天山野花蜜简称R(批号：080510)(市售);新疆伊犁养蜂场蜂蜜简称Y(批号：080515)(新疆维吾尔自治区维吾尔医医院制剂中心提供样品);甲醇为色谱级，其它试剂均为分析纯;5-HMF对照品(购于中国药品生物制品检定所，批号111626 - 20040)。
2方法与结果
2.1含量测定
2.1.1色谱条件色谱柱Waters Symmetry C18 (150 mm×4.6 mm，5 μm)，流动相为甲醇-水(10∶90);检测波长：285 nm;流速1.0 ml·min-1;柱温25 ℃。理论塔板数按5-HMF峰计算应不低于3 500。
2.1.2对照品贮备液的制备精密称取5-HMF对照品20 mg，置25 ml量瓶中，加甲醇适量溶解并稀释至刻度，摇匀，制成每毫升含0.8 mg的溶液。作为对照品贮备液。精密吸取对照品贮备液ml置250 ml量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得(每毫升含3.2 μg)。此溶液可在温度低于4℃冰箱中保存。
2.1.3供试品溶液的制备对无结晶的实验室样品，将其搅拌均匀。对有结晶的样品，在密闭情况下，置于不超过60℃的水浴中温热，振荡，待样品全部融化后搅匀，冷却至室温。精密称取2.0 g，置25 ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，用微孔滤膜(0.45 μm)滤过，即得。
2.1.4线性关系的考察 精密吸取上述5-MHF对照品溶液(每毫升含5-HMF 3.2 μg)2，20，40，60，80，100，120，140 μl注入液相色谱仪，记录峰面积。以进样量(μg)为横坐标，峰面积为纵坐标进行回归，得标准曲线方程为：Y = 20 528 X+4 220，r=0.999 8，结果表明，在0.0064～0.448 μg范围内，5-MHF峰面积与进样量具有良好的线性关系。
2.1.5精密度实验精密称取同一批蜂蜜样品(批号：080510)2.0 g，按供试品制备方法制备供试品溶液，取同一供试品溶液10μl，重复进样5次,记录5-HMF的峰面积值,计算RSD为0.84 %，表明精密度良好。
2.1.6稳定性实验精密称取同一批蜂蜜样品(批号：080510)按供试品制备方法制备供试品溶液，分别在同一天的不同时间进样5次(每隔2 h)在上述条件下依次测定。结果表明，8 h内供试品溶液基本稳定，5-MHF峰面积的RSD为2.04%。A.5-HMF对照品B.样品a.5-HMF图1高效液相色谱图
2.1.7重复性实验 精密称取同一批供试品6份(批号：080510)，按供试品制备方法制备供试品溶液，各取10 μl进样，测定含量，5-HMF峰面积的RSD为0.88 %。表明重复性良好。
2.1.8加样回收率实验取供试品(批号：080510)1.0 g，精密称定(n=6)，分别加入浓度为3.2 μg·ml-1的5-HMF 8 ml，按“2.1.3” 项下供试品溶液制备方法制备供试品溶液及进样10 μl测定含量，计算回收率，结果见表1。结果表明本方法的回收率良好。表1加样回收率实验结果
2.2样品制备及含量测定医学核心期刊论文发表
2.2.1蜂蜜不同温度、不同时间炼制样品的制备分别取蜂蜜500ml，倒入瓷器容器内，置于油浴锅加热，容器内蜂蜜分别温度达到80，90，100，110，120，130℃时恒温，每个温度分别加热时间为10，20，30，60，90 min，滤去蜂蜜白沫子，过滤，装入三角烧瓶内备用， HPLC法测定5-HMF含量。结果见表2。
2.2.2蜜膏剂用蜂蜜制剂中心炼蜜样品的制备新疆维吾尔自治区维吾尔医医院制剂中心为我区通过GPP认证，并生产规模及产品品种数量最全的制剂中心，按照本中心蜜膏剂炼蜜时不同批次取炼蜜前后样品，HPLC法测定5-HMF含量。结果见表3。
2.2.3各地州制剂中心炼制样品的制备选取我区通过GPP认证，有一定蜜膏剂生产规模的各地州维吾尔医医院取得联系，各地区生产蜜膏剂炼蜜时取得炼蜜前后样品，HPLC法测定5-HMF含量。结果见表4。
2.2.4蜜膏剂传统炼蜜工艺制备不同时间点炼蜜样品的制备取蜂蜜5 kg，置于倒入瓷器或表面代油漆的容器内，取原蜂蜜1号样，加热初次煮沸取2号样，然后每个2 min去1次样，依次到22 min，备用，HPLC法测定5-HMF含量。结果见表5。表2蜂蜜不同温度不同时间炼蜜样品5-HMF含量表3制剂中心炼蜜样品炼蜜前后5-HMF含量表4新疆各地制剂中心炼蜜样品炼蜜前后5-HMF含量表5蜜膏剂炼蜜工艺制备不同时间点炼蜜样品5-HMF含量
3讨论
维吾尔药蜜膏剂是维吾尔医药独有的一个剂型，并且应用历史长达2500年，制备方便，不需高级设备，储存方便及相对稳定，口感好，辅料蜂蜜占处方中药粉的2～3倍，维吾尔医常用的剂型，维吾尔医古籍文献中蜜膏剂的用量高达35%，炼蜜工艺是蜜膏剂制备当中关键一个工艺，虽然维吾尔药丸剂的炼蜜方法与中医药炼蜜方法相似，但蜜膏剂的炼蜜方法与丸剂炼蜜有很大的区别，丸剂练蜜方法与蜜膏剂练蜜方法的比较和探索试验得知两者之间有很大的区别，不论使用目的或炼蜜方法都不一样。目前部分人实际操作按照蜜膏剂炼蜜方法炼蜜，说起炼蜜就说丸剂炼蜜方法，因此产生炼蜜误为与丸剂炼蜜方法类似。
蜂蜜中5-HMF《中国药典》2005版Ⅰ部，蜂蜜标准内对5-HMF的含量进行了限定，在284和336 nm的波长处测定吸光度，吸光度差不得大于0.34。国家标准GB18796-2005蜂蜜标准中对新鲜蜂蜜中5-HMF含量规定不超过40 mg·kg-1。5-HMF反映蜂蜜的新鲜程度、加工处理条件优劣、鉴别蜂蜜中是否掺入人工转化糖等决定蜂蜜质量的重要指标[1~4]。
本研究应用高效液相色谱仪对“2.2.1”项下炼蜜样品中5-HMF的含量测定，通过自设定6个恒定温度和5个时间段蜂蜜加热，根据变化情况发现3个温度区域内5-HMF含量变化，温度80～100℃时5-HMF含量10倍左右变化(煮沸温度低线区)，变化情况逐步增高，温度110℃ 5-HMF含量第一时间段就20倍以上变化(煮沸温度中线区)，变化情况第一时间含量猛增并上升趋势，温度120～130℃ 5-HMF含量100~160倍之间变化(煮沸温度高线区)，变化情况很大，蜂蜜颜色也为深黑色。因此结合测定3种蜂蜜在6个恒定温度和5个时间段加热，结果也相同，测定不同蜂蜜沸点，蜂蜜自然沸点在106～116℃之间，这与蜂蜜含水量与相对密度有关，含水高沸点低，通过测定及分析得知，蜂蜜自然加热煮沸温度在煮沸温度低线区和煮沸温度中线区之内，因此蜂蜜加热最佳温度在自然煮沸温度之内加热，不需要恒定温度来加热，如恒定高温，蜂蜜沸点低的蜂蜜受到的影响大，5-HMF含量高。医学核心期刊论文发表
在本实验对不同地区、不同人、不同维吾尔医单位10批样品，一个单位不同批次10批样品以及实验室自制2批样品5-HMF含量定量分析，“2.2.2”项下样品炼蜜前都在合格范围之内，炼蜜后超出了国家规定的含量范围，并在43.8～102.8 mg·kg-1范围变化。“2.2.3”项下样品炼蜜前除了1个地区样品超出范围之外其它都合格，炼蜜后超出了国家规定的含量范围，并在15.70 ～154.86 mg·kg-1范围变化。通过“2.2.4”项下样品验证了样品“2.2.2”项下和“2.2.3”项下样品2批(R、Y)实验结果，炼蜜前5-HMF含量为7.56 mg·kg-1和4.62 mg·kg-1，炼蜜后逐步上升到113.19 mg·kg-1和104.19 mg·kg-1，时间为22 min。
普遍认为，5-HMF有一定的毒副作用，但文献报道，5-HMF近几年来研究表明其还具有抗氧化、改善血液流变学、影响甘草酸代谢促进甘草酸和次甘草酸抑制肿瘤、抗炎、降低血中胆固醇对人体有利的作用[5~8]。实验结果蜂蜜炼蜜前后，加热使5-HMF含量显著提高，时间的延长也使样品中5-HMF含量增加，不同样品测定结果认为炼蜜温度以蜂蜜沸点温度，炼蜜时间为微沸20 min以内，蜜膏剂炼蜜时5-HMF含量在200 mg·kg-1范围之内，蜂蜜炼蜜后在5-HMF的有效及安全剂量范围研究尚未见报道，因此，我们下一步对蜜膏剂工艺中蜂蜜炼蜜后产生的5-HMF 有效及安全剂量范围进行研究，确定蜜膏剂炼蜜最佳工艺及炼蜜质量标准。
