HPLC法测定甲肿消及大鼠血清中土贝母苷甲的含量
甲肿消处方由夏枯草、土贝母等组成,按适当工艺制成浓度为3 g/mL原药材的浸膏剂。动物和临床试验证明,该制剂具有较好的化痰散结、治疗甲状腺功能亢进型甲状腺肿大的作用。但其作用途径与机理尚不清楚,故我们采用血清药理学的方法,观察本制剂大鼠灌胃给药后的含药血清对甲状腺细胞增殖的影响,以阐明本方治疗甲状腺功能亢进的机理。土贝母为葫芦科植物土贝母[Bolbostemma paniculatum (Maxim.) Franquet]的干燥块茎,有散结、消肿、解毒之功效。从中分离出的土贝母苷甲是其主要有效成分,具有抗肿瘤、抗病毒、免疫抑制等多种活性[1]。因此,我们采用RP-HPLC法建立了大鼠含药血清中的代表性成分土贝母苷甲(土贝母)的含量测定方法,为进一步阐明本方治疗甲状腺功能亢进的机理提供分析方法。
1 仪器与试药
LC-10A高效液相色谱仪和SPD-10A紫外检测器(日本导津公司)；XW-80A涡旋混合器；PHS-25型酸度计；TGL-16 g台式高速离心机；ME215P型分析天平(Sartorius)；Diamonsil C18分析柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；Easyguard保护柱(迪马公司)；固相萃取小柱(C18SPE,200 mg,3 mL,瓦里安公司)。体重(330±10)g的雄性Wister大鼠(中国医学科学院动物中心,合格证号：SCXK-2005- 0013)。夏枯草、土贝母等药材购自燕京饮片厂,由本院药理实验室鉴定,符合2005版《中华人民共和国药典》标准；土贝母苷甲(批号1536-200001)对照品由中国药品生物制品检定所提供。甲醇、乙腈等试剂均为色谱用；水为高纯水。
2.1 含药血清的制备
2.1.1 甲肿消制剂的制备
按处方量配制,水煎煮提取,过滤,滤液减压浓缩后得浓度为每毫升相当于3 g原药材的浸膏剂。
2.1.2 大鼠含药血清的制备
选取体重(330±10)g的雄性Wistar大鼠30只,其中20只按体重5 mL/kg的剂量灌胃给予甲肿消浸膏剂,10只按体重给予同剂量生理盐水,每天2次,连续7 d。末次灌胃后开始计时,于60 min后,用玻璃毛细管自乙醚麻醉大鼠眼底采血,收集血样于离心试管中,放置2 h促凝, 1 500 r/min离心10 min,吸取上清液,0.22 μm滤膜过滤,滤液即为含药血清和空白血清,-20 ℃冷冻保存。
2.2 甲肿消和大鼠含药血清中土贝母苷甲的含量测定
2.2.1 甲肿消样品的前处理
精密称取甲肿消浸膏约3 g,分别用甲醇(15、15、10 mL)超声(300 W,55 kHz)提取3次,每次5 min,0.45 μm滤膜过滤,合并滤液,加甲醇定容至50 mL。精密量取10 mL,减压除去溶剂,残渣精密加入甲醇2 mL,超声溶解,0.45 μm滤膜过滤,取续滤液作为含量测试试液。
2.2.2 血清样品中土贝母苷甲的前处理
冻存血清于室温解冻备用。选取C18SPE柱(200 mg,3 mL,60 μm),先用2 mL甲醇冲洗,再用2 mL纯水冲洗活化；精密量取血清1 mL上样,弃去流出液,用2 mL纯水冲洗,再用1 mL甲醇洗脱,收集甲醇洗脱液作为供试液。 护理论文发表
2.2.3 色谱条件
色谱柱：Diamonsil C18(250 mm×4.6 mm, 5 μm)和Easyguard保护柱；流动相：甲醇-水(65∶35)；流速：1 mL/min；检测波长：214 nm；进样10 μL。色谱图见图1。
2.2.4 标准曲线的测定
精密称取土贝母苷甲标准品11.8 mg,用65%甲醇配成浓度为118 μg/mL的标准溶液,然后分别用65%甲醇稀释制成土贝母苷甲浓度为14.75、29.5、59、88.5、118 μg/mL,按“2.2.3”项色谱条件测定。以土贝母苷甲的峰面积A和浓度C作图,进行线形回归,得标准曲线方程：A＝2 503.1C－2 300.5,R2＝0.999 6,土贝母苷甲在14.75～118 μg/mL的浓度范围内线性良好。
取土贝母苷甲浓度为118 μg/mL的标准溶液,分别精密量取一定量,加入空白血清,使土贝母苷甲浓度为1.18、2.36、11.8、14.75、29.5、59、88.5 μg/mL,按“2.2.2”和“2.2.3”项操作,记录土贝母苷甲的峰面积。以峰面积A和浓度C作图,进行线形回归,得标准曲线方程：A＝2 458.2C＋2 127.8,R2＝0.999 3,血清样品中土贝母苷甲在1.18～88.5 μg/mL的浓度范围内线性良好。
2.2.5 精密度和回收率测定
取土贝母苷甲浓度为59 μg/mL的标准溶液,按“2.2.3”项色谱条件测定3次。将峰面积代入标准曲线方程,计算土贝母苷甲的浓度为(59.40±2.00)μg/mL,与配制浓度比较,计算精密度,RSD＝3.39%。
取土贝母苷甲标准溶液加入空白制剂中,制成浓度为59 μg/mL的样品溶液,分别按“2.2.1”和“2.2.3”项操作,测定3次。将峰面积代入标准曲线方程,计算土贝母苷甲的浓度,计算回收率为(103.49±3.49)%。
取土贝母苷甲标准溶液加入空白血清中,制成浓度为29.5 μg/mL的血清样品溶液,按“2.2.2”和“2.2.3”项操作,记录土贝母苷甲的峰面积。将峰面积代入标准曲线方程计算浓度,与配制浓度比较,平均回收率为(104.70±4.69)%(n＝3)。
2.2.6 甲肿消和大鼠血清样品中土贝母苷甲含量的测定 护理论文发表
精密称取甲肿消浸膏3.086 g,按“2.2.1”和“2.2.3”项操作；精密量取灌胃给予甲肿消后的大鼠血清1 mL,按“2.2.2”和“2.2.3”项操作。分别记录土贝母苷甲的峰面积。将峰面积代入标准曲线方程计算浓度,每克制剂含土贝母苷甲995.3 μg,灌胃给予甲肿消后大鼠血清中土贝母苷甲浓度为3.19 μg/mL。
3 讨论
制备含药血清过程中所用器具应热压灭菌,试验中应采用无菌操作方法,血样不可使用肝素等抗凝剂,静置约1 h等血液自然凝固后离心,可得到含药血清[1]。
试验中考察了氯仿、甲醇和无水乙醇等提取溶剂和提取方法,发现以甲醇为提取溶剂,采用超声方法提取率高,杂质干扰少[2]。由于大鼠血清中土贝母苷甲含量很低,采用常规萃取方法难于定量,回收率也不高。因此,试验中采用固相萃取法处理血清样品,经优化后选取C18SPE柱(200 mg,3 mL,60 μm)血清样品直接上样,纯水冲洗杂质,甲醇洗脱,经精密度和回收率试验证明本方法快速、简便、准确,可用于测定血清中土贝母苷甲的含量。
